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江苏激光联盟导读:
近日,来自韩国基础科学研究所分子光谱与动力学中心的研究团队开发了一种新型光学显微镜——激光扫描反射矩阵显微术(laser-scanning reflection-matrix microscopy, LS-RMM)方法,在深层组织光学成像方面取得了重大突破。该研究成果2020年11月12日发表在Nature上。
共聚焦技术已经成为光学显微镜的一个最重要的技术进步。共焦显微技术是由美国科学家M.Minsky在1957年提出的,当时的主要目的是消除普通光学显微镜在探测样品时产生的多种散射光。20世纪60年代通过提高扫描精度突破了普通宽场成像的分辨率限制,在20世纪80年代研制成商用共焦显微镜。共焦显微镜分为普通光照明激发和激光照明激发两种类型,而以后者应用最为广泛。共聚焦成像是用于观察深层(厚)组织的光学显微镜中使用最广泛的配置之一,因为它具有通过多次光散射来抑制离焦平面的信号和其他有害噪声的能力。该技术本身已被用于共聚焦反射/荧光成像。但是,在样本引起的像差的情况下,包含物体信息的信号会由于点扩展函数(PSF)的模糊而从共焦针孔散开。从而降低了图像对比度,并且随着成像深度的增加,分辨能力逐渐丧失。解决样品引起的像差并在散射介质内实现理想的衍射极限成像的关键是将非共聚焦信号或到达共聚焦针孔以外位置的信号连贯地重新聚焦到共聚焦检测位置。由于多散射噪声以及空间像差信号会到达非共聚焦位置,因此选择性地重新聚焦畸变信号而不是多散射噪声至关重要。到目前为止,与荧光成像相比,在无标记反射成像中进行选择性重聚焦非常困难,这主要是因为信号和多重散射噪声具有相同的光频率。
IBS分子光谱与动力学研究中心的研究人员开发的反射矩阵显微镜示意图。
位于韩国首尔的基础科学研究所分子光谱与动力学中心Choi Wonshik教授领导的研究团队开发了一种新型光学显微镜——激光扫描反射矩阵显微术(laser-scanning reflection-matrix microscopy, LS-RMM)方法,该方法可以记录样本在其相位和振幅方面的非共聚焦和共聚焦信号。这些测量结果共同构成了一个反射矩阵,可量化光-介质相互作用的完整输入-输出响应。它结合了共焦显微镜和光学相干断层扫描技术(Optical CoherenceTomography, OCT)的常规光学相干显微镜(optical coherence microscopy, OCM)可测量反射矩阵的一个子集。相当于这种新型显微镜结合了硬件和计算自适应光学(adaptive optics, AO)的力量,后者是一种最初为地面天文学开发的技术,用于纠正光学畸变。传统的共焦显微镜只测量照明焦点处的反射信号,并丢弃所有失焦光,而反射矩阵显微镜则记录了焦点以外位置的所有散射光子。该研究团队利用在2017年开发的一种名为闭环单散射累积(closed-loop accumulation of single scattering, CLASS)的新型AO算法,对散射光子进行计算校正。该算法利用所有散射光选择性地提取弹道光,并纠正严重的光差。与大多数传统的AO显微镜系统需要明亮的点状反射镜或荧光物体作为引导相比,反射矩阵显微镜在工作时不需要任何荧光标记,也不依赖于目标的结构。此外,可校正的像差模式数量是传统AO系统的10倍以上。
反射矩阵显微镜有一个很大的优势,它可以直接与已经广泛应用于生命科学领域的传统双光子显微镜相结合。研究人员测试了CLASS算法纠正极端高阶像差的能力,试图通过完整的颅骨对小鼠大脑中的神经元结构进行成像。老鼠头骨由精细的微结构组成,这些微结构会导致严重的光学像差和强烈的多重散射噪声。为了消除双光子显微镜的激发光束所经历的畸变,该团队在反射矩阵显微镜内部署了基于硬件的自适应光学元件,以抵消小鼠头骨的畸变。
他们通过拍摄小鼠头骨后神经元树突棘的双光子荧光图像,展示了新显微镜的能力,空间分辨率接近衍射极限。通常情况下,传统的双光子显微镜如果不将脑组织从头骨中完全取出,就无法解析树突棘的精细结构。这是一项非常重要的成就,该韩国研究团队首次通过完整的小鼠头骨展示了神经网络的高分辨率成像。这意味着,现在有可能研究小鼠大脑的最原始状态。
完整的老鼠头骨的TPF成像
进行这项研究的Yoon Seokchan教授和研究生Lee Hojun说:"通过纠正波前畸变,我们可以将光能聚焦在活体组织内部所需的位置。我们的显微镜可以让我们调查活体组织深处的细微内部结构,而这些结构是任何其他手段都无法解析的。这将极大地帮助我们进行疾病的早期诊断,加快神经科学研究的步伐。"
研究人员下一步的研究方向是尽量缩小显微镜的外形尺寸,提高其成像速度。目标是开发出一种无标签的高成像深度的反射矩阵显微镜,用于临床。
Choi Wonshik副主任表示,反射矩阵显微镜是超越传统光学显微镜局限性的下一代技术。这将使我们拓宽对光通过散射介质传播的理解,扩大光学显微镜可以探索的应用范围。
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本文来源:Seokchan Yoon et al, Laser scanning reflection-matrix microscopy for aberration-free imaging through intact mouse skull, Nature Communications (2020). DOI: 10.1038/s41467-020-19550-x
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